银离子对大肠埃-希杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌作用机理研究

中国清华大学材料工程和科学系         Q. L. Feng   J. wu   F. Z. Cui.

中国清华大学生物科学和生物工程系     G. Q. Chen

韩国Paichai 大学先进材料工程系        T. V. Kim.  J. O. Kim.

1999.4.30提交，2000.3.1修改，2000,3.9接受。

摘要：

为了了解银离子对微生物抑制的机理，用硝酸银对被称作G-的大肠杆菌（Escherichia coli ）和G+的金黄色葡萄球菌（S.aureus）的两种菌株进行处理。研究中使用了联合电子显微镜和X—线微分析方法。

在经过Ag+的作用后，大肠杆菌和金葡菌细胞发生了相同的形态学改变。细胞浆膜从细胞壁上分离开来，在细胞中央出现了明显的电子—光区域，它包括了致密的DNA分子。有很多小的电子密度结节围绕在细胞壁周围或沉淀在细胞内，X—线微分析检测到电子密度结节和胞浆内有银和硫元素的存在。这揭示出银的抗菌机理：Ag+的作用使DNA 失去它的复制能力并且导致蛋白质的失活。金葡球菌的形态学改变较大肠杆菌轻微，意味着金葡球菌对银离子的抑菌作用有抵抗作用。

关键词：银离子、抗菌机理、DNA分子、形态学改变、电子显微镜

引言

银离子具有广谱的、强大的抑菌作用已久为人知，银的一些形态已被引入用来有效治疗烧伤、严重的慢性骨髓炎、尿道感染和中心静脉导管感染等疾病。

在我们以前的一项工作中，抗菌陶瓷已成功制造出来。那是以羟磷灰石(HA)为基材，加入硝酸银后用湿化学过程完成的。它证明了羟磷灰石涂层中的植入材料用银处理后，显示出优秀的抗菌作用。也有报告称，把Ag + 放入有许多微小孔隙的HA涂层，可以作为生命活性物质传递系统，可以缓慢释放抗菌物质。一些方案已被发展为解释Ag +的抑菌效果。一般认为，重金属通过与SH基的结合与蛋白质起反应。这导致蛋白质的失活。最近的微生物学和化学试验揭示Ag +与巯基相互作用，在灭活细菌的过程中扮演了一个基本的角色，揭示大量的银在有氧的多水的介质中，催化了微生物的氧化过程导致它们完全毁灭。银和过氧化氢共同作用影响大肠杆菌的生存。Ag和过氧化氢的联合的毒性作用可能损坏了细胞的蛋白质。银离子的抗微生物机理仍没有全部被了解。Ag+ 对细菌的作用可能很复杂。然而对形态和结构的直接观察，可以对了解银的抗菌效应和抑菌过程提供有用的信息。

材料和方法

（略）

结果

Ag+处理后的大肠杆菌形态学改变。

图1 显示正常的大肠杆菌内部结构，清晰显示细胞的电子密度在无外界环境的干扰时，细胞的正常状态。DNA分子、电镜下的电子-光物质 如图1（b）箭头所示，随意分布在细胞内几乎每个区域。

（图2 ）显示加入Ag+后，E.Coli细胞显著的形态学改变。图2(a)是对银作用细胞的总的情况。图2(b)-(f)是放大后的观察。银作用后，显著的电子-光区域经常出现在大肠埃-希菌的细胞中央图2(a)箭头所示。在电子-光区域的中央可以清楚地看到一些浓缩的物质，就像互相绞在一起的线，如图2(b)箭头所示。

银处理过的大肠杆菌细胞浆膜和胞壁之间，出现了一个大的裂隙如图2(c)。相比较于图1的正常胞浆膜，银离子的作用使得胞浆膜和胞壁分离开来。

图2(d)箭头处可以清楚地看到电子密度的结节围绕着细胞壁。这些结节也存在于细胞浆中图2(a)-(f)。但是电子-光区域内没有电子密度结节。观察到大量的电子密度结节围绕在电子-光区域周围，但却不在这个区域内，这很有意思。这可能说明电子-光区域有防止电子密度结节进入的功能。与之相对比，在控制样本内，未发现电子密度结节。

然而，图2(e) 中可见相互矛盾的现象。观察到细胞是由大量弥漫的、大的电子密度结节组成，而无电子-光区域和浓缩的DNA分子。在这种细胞中，没有细胞壁。这种细胞就像是一个包含电子密度结节和胞浆的区域，可能是银作用过的细胞将要死亡的特征形态。相同的情况只出现在与银有关的物质中。

图2(f)中看到在一些细胞中，细胞壁已被严重损坏了。在细胞内，有很多结节围绕着电子-光区域。对小的电子密度结节和电子-光区域外的胞浆进行X-线微分析，显示大量的银和硫，说明银离子进入细胞并与包括硫在内的一些元素结合。

讨论：

用银处理金葡菌和大肠杆菌后，发生了相同的现象，即：胞浆膜皱缩或从胞壁分离，在细胞中央出现电子-光区域，DNA分子位于这个区域的中央。在细胞内可以检测到银离子。所有这些现象说明银离子攻击细菌的可能的机理，和Gram阳性菌和Gram阴性菌-抵御银离子攻击的防御系统是一样的。

DNA是细胞内最重要的遗传信息，任何对—的损害都可导致机体的突变或死亡，自然情况下，细胞可以保护DNA分子免受侵害，电子-光区域如图2(a)对DNA分子有这样的保护功能。银离子存在于电子密度结节内（图3(a)），而在电子-光区域内几乎没有电子密度结节的现象，说明电子-光区域对DNA的保护功能。然而，直到现在，我们还不知道电子-光区域是如何形成的，并且在这区域内，除了DNA分子外，其他主要成分是什么。

Nover等人报告说，细胞为对抗有害的热刺激，会产生一些小分子蛋白质，并且在细胞核的周围聚集起来。虽然热刺激与银离子对细胞的影响不同，但这些都是外部环境对微生物的侵害。所以，当遭受银离子攻击后，细胞产生刺激蛋白，聚集在细胞核周围保护DNA分子是可能的。如图2(b)然而如果攻击非常强烈，以致这种应激反应来不及有效发挥作用，电子-光区域或甚至是细胞壁就会毁坏，并且电子密度结节就会充满细胞。如图2(e)

现在知道DNA分子仅仅在放松的状态下才能有效地进行复制，在浓缩状态下，DNA分子就会失去这种复制能力，这已在目前的实验中被证实了。把银处理过的细胞移到新鲜的液态—培养基中继续培养，细胞不能生长和繁殖。这个实验说明银离子抗菌作用的机理可能是：DNA的浓缩状态失去了复制的能力。

硫在EDAX谱中的存在支持银离子抗菌作用的另一个机理：银与蛋白质上的巯基结合，使酶失活。巯基是酶有活性的一个重要基团。有报告说，重金属通过与巯基结合使蛋白质失活。另一方面，银是一种可以使蛋白质沉淀的重金属。所以，银进入细菌细胞，可以导致蛋白质在细胞内沉淀。考虑到这些，那么在电子-光区域外的电子密度结节应该是银和蛋白质沉淀物的复合物。

金葡菌形态改变较轻微，可能是由于它的结构特征。Gram+和Gram-菌细胞的细胞壁有显著不同。很明显，Gram+菌细胞壁的多肽比Gram-菌厚的多。金葡菌更厚的胞壁在保护细胞不让银离子进入胞浆方面，起了很大作用。

目前的研究，给出了抗微生物植入物实际应用的一些建议。只有当银离子可以从植入物中释放出来才有抗菌效果。释放出的银离子穿透细胞壁进入细胞，结果使得DNA分子成为浓缩状态，同时与蛋白质发生反应。所有这些导致微生物损害或死亡。见图2

结论：

比较了银离子对大肠杆菌和金葡菌的影响结果，我们发现：

1，  细胞内电子-光区域中央DNA由自由状态变成浓缩状态。

2，  在细胞壁或电子-光区域周围出现电子密度结节。

3，  X-线微分析显示银存在于电子密度结节、细胞浆和DNA分子中。

以上结果引出关于银离子对大肠杆菌和金葡菌的抗菌机理的结论：

1， 银离子有致细胞变性的作用，作为对抗这种作用的一种反应，DNA分子成为浓缩状态并失去其复制能力

2， 银离子与蛋白质上的巯基相互作用，导致细菌蛋白质的失活。